2 × Pfu PCR Campuran

A-1 Citakan

■ témplatna ngandung kokotor protéin atanapi panghambat Taq, sareng sajabana ——Murni témplat DNA, ngaleungitkeun kokotor protéin atanapi nimba témplat DNA nganggo kit pemurnian.

■ Dématurasi témplat henteu lengkep ——Sapatuh naékkeun suhu dématurasi sareng manjangkeun waktos dématurasi.

■ Dégradasi témplat ——Siapkeun deui témplat.

A-2 Primer

■ Kualitas primér anu lemah ——Re-synthesize primér.

■ degradasi Primer ——Kuatkeun primér konsentrasi luhur kana volume leutik pikeun pelestarian. Hindarkeun sababaraha katirisan sareng cair atanapi jangka panjang 4 ° C cryopreserve.

■ Desain primér anu henteu leres (sapertos panjang primér henteu cekap, dimer kabentuk antara bahan dasar, sareng sajabana) -Résainer modél (hindarkeun pembentukan primer dimer sareng struktur sékundér)

A-3 Mg²⁺konsentrasi

■ Mg²⁺ konsentrasi teuing handap --—Bener ningkatkeun Mg²⁺ konsentrasi: Optimalkeun Mg²⁺ konsentrasi ku séri réaksi ti 1 mM ka 3 mM kalayan interval 0,5 mM pikeun nangtoskeun optimal Mg²⁺ konsentrasi pikeun tiap témplat sareng buku dasar.

Suhu suhu A-4

■ Suhu anil anu luhur mangaruhan kana beungkeutan primér sareng témplat. —— Ngurangan suhu anilasi sareng ngaoptimalkeun kaayaan kalayan gradién 2 ° C.

A-5 waktos penyuluh

■ Waktu penyuluhan singget —— Ningkatkeun waktos panyambung.

Fénomena: Sampel négatip ogé nunjukkeun pita urutan target.

A-1 Kontaminasi PCR

■ Kontaminasi silang tina target udagan atanapi produk amplifikasi —— Ati-ati henteu pipet sampel anu ngandung urutan udagan dina sampel négatip atanapi tumpahkeunana ti tabung centrifuge. Réagen atanapi alat-alat kedah diropea pikeun ngaleungitkeun asam nukléat anu aya, sareng ayana kontaminasi kedah ditangtoskeun ngalangkungan ékspérimén kontrol négatip.

■ Kontaminasi réagen ——Alikot réagen sareng simpen dina suhu anu handap.

A-2 Perdanar

■ Mg²⁺ konsentrasi teuing handap --—Bener ningkatkeun Mg²⁺ konsentrasi: Optimalkeun Mg²⁺ konsentrasi ku séri réaksi ti 1 mM ka 3 mM kalayan interval 0,5 mM pikeun nangtoskeun optimal Mg²⁺ konsentrasi pikeun tiap témplat sareng buku dasar.

■ Desain primér anu teu leres, sareng urutan target ngagaduhan homologi sareng urutan non-target. ——Rebulan desain ulang.

Fénoména: Pita penguat PCR henteu saluyu sareng ukuran anu diarepkeun, boh ageung atanapi alit, atanapi kadang-kadang duanana pita penguat khusus sareng pita amplifikasi non-spésifik lumangsung.

A-1 Primer

■ Goréng kakhususan primér

——Resain desain ulang.

■ Konséntrasi primér teuing tinggi ——Benerkeun ningkatkeun suhu dématurasi sareng manjangkeun waktos dématurasi.

A-2 Mg²⁺ konsentrasi

■ Anu Mg²⁺ konsentrasi teuing tinggi ——Benerkeun ngirangan konsentrasi Mg2 +: Optimalkeun Mg²⁺ konsentrasi ku séri réaksi ti 1 mM ka 3 mM kalayan interval 0,5 mM pikeun nangtoskeun optimal Mg²⁺ konsentrasi pikeun tiap témplat sareng buku dasar.

A-3 Polimérase Terpanjang

■ Jumlah énzim anu kaleuleuwih —— Ngurangan jumlah énzim anu saluyu dina interval 0,5 U.

Suhu suhu A-4

■ Suhu anil teuing handap ——Sapatna naékkeun suhu anil atanapi adopsi metode annealing dua tahap

Siklus PCR A-5

■ Teuing siklus PCR —— Ngurangan jumlah siklus PCR.

A-1 Primer-— Spésifisitas lemah ——Resain ulang primér, robih posisi sareng panjang primér pikeun ningkatkeun kakhususan na; atanapi ngalaksanakeun PCR bersarang.

DNA Citakan A-2

——Témplatna henteu murni ——Murni témplat atanapi nimba DNA nganggo kit pemurnian.

A-3 Mg²⁺ konsentrasi

——Mg²⁺ konsentrasi teuing tinggi ——Benerkeun ngirangan Mg²⁺ konsentrasi: Optimalkeun Mg²⁺ konsentrasi ku séri réaksi ti 1 mM ka 3 mM kalayan interval 0,5 mM pikeun nangtoskeun optimal Mg²⁺ konsentrasi pikeun tiap témplat sareng buku dasar.

A-4 dNTP

—— Konsentrasi dNTP seueur teuing —— Ngurangan konsentrasi dNTP kalayan pantes

A-5 Suhu Annealing

——Tuh suhu anil anu handap ——Sapatna naékkeun suhu anil

Siklus A-6

—— Kacida seueur siklusna—— Optimalkeun jumlah siklusna

Léngkah munggaran nyaéta milih polimérase anu pas. Polimérase Taq rutin henteu tiasa dirobih kusabab kurangna kagiatan exonuclease 3'-5, sareng henteu cocog pisan bakal ngirangan épisiénsi perpanjangan fragmen. Ku alatan éta, Taq polimérase sacara épéktip moal tiasa nguatkeun fragmen target anu langkung ageung tibatan 5 kb. Taq polimérase kalayan modifikasi khusus atanapi polimérase kasatiaan luhur sanésna kedah dipilih pikeun ningkatkeun épisiénsi penyuluhan sareng nyumponan kabutuhan amplifikasi fragmen panjang. Salaku tambahan, amplifikasi tina fragmen panjang ogé meryogikeun pangaluyuan anu sami pikeun desain primér, waktos denaturasi, waktos perpanjangan, buffer pH, sareng sajabana Biasana, bahan primér kalayan 18-24 bp tiasa nyababkeun ngahasilkeun anu langkung saé. Dina raraga nyegah karusakan témplat, waktos dématurasi dina 94 ° C kedah dikirangan janten 30 detik atanapi kirang per siklus, sareng waktos naékkeun suhu kana 94 ° C sateuacan amplifikasi kedah kirang ti 1 mnt. Sumawona, netepkeun suhu perpanjangan sakitar 68 ° C sareng ngararancang waktos perpanjangan numutkeun tingkat 1 kb / mnt tiasa mastikeun amplifikasi anu épéktip pikeun fragmen panjang.

Tingkat kasalahan amplifikasi PCR tiasa dikirangan ku ngagunakeun rupa-rupa poliméras DNA kalayan kasatiaan luhur. Diantara sadaya polimérase DNA Taq anu dipendakan dugi ka ayeuna, énzim Pfu ngagaduhan tingkat kasalahan anu panghandapna sareng kasatiaan pangluhurna (tingali tabel anu dipasang). Salaku tambahan kana pilihan énzim, panaliti salajengna tiasa ngirangan tingkat mutasi PCR ku ngaoptimalkeun kaayaan réaksi, kalebet ngaoptimalkeun komposisi panyangga, konsentrasi polimérase termostér sareng ngaoptimalkeun jumlah siklus PCR.