Modél Amplifikasi Perpustakaan TIANSeq NGS

Ayeuna, téknologi sekuens kaluaran tinggi utamina dumasarkeun kana téknologi sekuens generasi salajengna. Kusabab panjang bacaan téknologi sekuens generasi salajengna diwatesan, urang kedah ngarobih sekuen panjang lengkep janten perpustakaan fragmen alit kana sekuen. Numutkeun kabutuhan percobaan séri anu béda-béda, urang biasana milih sekuen hiji-hiji atanapi sekuen dua kali. Ayeuna fragmen DNA perpustakaan ngaruntuy generasi salajengna sacara umum disebarkeun dina kisaran 200-800 bp.

a) DNA goréng kualitas sareng ngandung sambetan. Anggo sampel DNA kualitas luhur pikeun nyegah ngahambat aktivitas énzim.

b) Jumlah sampel DNA henteu cekap nalika ngagunakeun metode PCR-gratis pikeun nyusun perpustakaan DNA. Nalika input tina DNA terfragmentasi ngaleuwihan 50 ng, alur kerja bébas PCR tiasa sacara selektif dilaksanakeun nalika prosés pangwangunan perpustakaan. Upami nomer salin perpustakaan kirang teuing pikeun langsung diruntuy, perpustakaan DNA tiasa diageungkeun ku PCR saatos ligation adaptor.

c) Kontaminasi RNA nyababkeun kontaminasi DNA awal anu teu akurat Kontaminasi RNA tiasa aya dina prosés pemurnian DNA génomik, anu tiasa ngakibatkeun kuantisasi DNA anu teu akurat sareng teu muat DNA dina waktos pangwangunan perpustakaan. RNA tiasa dipiceun ku nyampurkeun sareng RNase.

A-1

a) Potongan leutik (60 bp-120 bp) nembongan Potongan leutik biasana fragmen adaptor atanapi dimers anu diwangun ku adaptor. Pemurnian ku manik magnetik Agencourt AMPure XP sacara efektif tiasa ngaleungitkeun fragmen adaptor ieu sareng mastikeun kualitas urutanna.

b) Potongan ageung nembongan di perpustakaan saatos amplifikasi PCR Ukuran fragmen DNA perpustakaan bakal ningkat 120 bp saatos adaptorna ligated. Upami sempalan DNA ningkat ku langkung ti 120 bp saatos ligation adaptor, éta panginten disababkeun ku amplifikasi fragmen abnormal tina amplifikasi PCR kaleuleuwihan. Ngurangan jumlah siklus PCR tiasa nyegah kaayaan.

c) Ukuran henteu normal tina fragmen DNA perpustakaan saatos ligation adaptor Panjang adaptor dina kit ieu nyaéta 60 bp. Nalika dua tungtung sempalan dilebetkeun kana adaptor, panjangna ngan ukur bakal ningkat 120 bp. Nalika nganggo adaptor anu sanés anu disayogikeun ku kit ieu, mangga hubungi anu nyayogikeun kanggo nyayogikeun inpormasi anu relevan sapertos panjang adaptor. Punten mastikeun yén alur kerja sareng operasi percobaan nuturkeun léngkah-léngkah anu dijelaskeun dina manual.

d) Ukuran fragmen DNA henteu normal sateuacan adaptor ligation Alesan pikeun masalah ieu tiasa disababkeun ku kaayaan réaksi anu salah salami fragméntasi DNA. Waktos réaksi anu sanés kedah dianggo pikeun input DNA anu sanés. Upami input DNA langkung ti 10 ng, urang nyarankeun pikeun milih waktos réaksi 12 mnt salaku waktos awal pikeun ngaoptimalkeun, sareng ukuran fragmen anu dihasilkeun dina waktos ieu utamina dina kisaran 300-500 bp. Pamaké tiasa ningkatkeun atanapi ngirangan panjang fragmen DNA salami 2-4 mnt numutkeun sarat nyalira pikeun ngaoptimalkeun fragmen DNA kalayan ukuran anu diperyogikeun.

A-2

a) Waktos fragméntasi henteu dioptimalkeun Upami DNA anu terfragmentasi leutik teuing atanapi ageung teuing, mangga tingal Pedoman pikeun Pamilihan Waktos Fragmentasi anu disayogikeun dina instruksi pikeun nangtoskeun waktos réaksi, sareng anggo titik waktos ieu salaku kontrol, tambahan ogé sistem réaksi pikeun manjangkeun atanapi nyingcetkeun 3 mnt supados langkung pas dina waktos fragméntasi.

A-3

Sebaran ukuran normal tina DNA saatos perlakuan fragméntasi

a) Metode pencairan anu lepat tina réagen fragméntasi, atanapi réagen henteu lengkep dicampur saatos ngalebur. Ngalenyepan énzim Campuran 5 × Fragmentasi dina és. Sakali cair, gaul réagen merata ku cara némbalan kana pipah pipina. Entong vortex réagen!

b) Sampel input DNA ngandung EDTA atanapi polutan séjén Ngirangan ion uyah sareng agén chelating dina léngkah pemurnian DNA anu penting pisan pikeun kasuksésan ékspérimén. Upami DNA leyur dina 1 × TE, anggo metode anu disayogikeun dina paréntah pikeun ngalakukeun fragméntasi. Upami konsentrasi EDTA dina leyuranna henteu pasti, disarankeun pikeun nyucikeun DNA sareng ngaleyurkeun kana cai anu didéionisasi kanggo réaksi salajengna.

c) Kualifikasi DNA awal anu teu akurat Ukuran DNA fragmented raket patalina sareng jumlah input DNA. Sateuacan perlakuan fragméntasi, kuantifikasi DNA anu akurat ngagunakeun Qubit, Picogreen sareng metode sanésna penting pisan pikeun nangtoskeun jumlah DNA dina sistem réaksi.

 d) Persiapan sistem réaksi henteu nuturkeun pitunjuk Persiapan sistem réaksi fragmentasi kedah dilaksanakeun dina és sacara ketat numutkeun pitunjukna. Pikeun mastikeun pangaruh anu pangsaéna, sadaya komponén réaksi kedah disimpen dina és sareng persiapan sistem réaksi kedah dilaksanakeun saatos pendinginan lengkep. Saatos persiapanna réngsé, punten sintreuk atanapi pipet kanggo campuran sakedik. Entong vortex!

1. Metode campuran anu teu leres (vortex, osilasi telenges, sareng sajabana) bakal nyababkeun panyebaran fragmen perpustakaan anu teu normal (sapertos gambar dina gambar ieu), sahingga mangaruhan kualitas perpustakaan. Kusabab kitu, nalika nyiapkeun leyuran réaksi Campuran Fragmentasi, mangga di pipir sacara lembut ka luhur sareng ka handap pikeun dicampur, atanapi nganggo ujung ramo pikeun sintreuk sareng gaul rata. Ati-ati henteu dicampur sareng pusaran.

2. DNA purity tinggi kedah dianggo pikeun pangwangunan perpustakaan

■ Integritas DNA anu saé: Pita éléktroforesis langkung ti 30 kb, tanpa buntut

■ OD260 / 230:> 1.5

■ OD260 / 280: 1.7-1.9

3. Jumlah input DNA kedah akurat Disarankeun ngagunakeun metode Qubit sareng PicoGreen pikeun ngitung DNA, tibatan Nanodrop.

4. Eusi EDTA dina larutan DNA kedah ditangtoskeun EDTA ngagaduhan pangaruh anu hébat kana réaksi fragméntasi. Upami eusi EDTA tinggi, pemurnian DNA kedah dilakukeun sateuacan tés salajengna.

5. Larutan réaksi fragméntasi kedah disiapkeun dina és Prosés fragméntasi peka kana suhu réaksi sareng waktos (utamina saatos nambihan panambah). Dina urutan pikeun mastikeun akurasi waktos réaksi, punten nyiapkeun sistem réaksi dina és.

6. Waktos réaksi fragméntasi kedah akurat waktos réaksi tina léngkah fragméntasi langsung bakal mangaruhan ukuran produk fragmen, sahingga mangaruhan distribusi ukuran fragmen DNA dina perpustakaan.

1. Naon jinis sampel anu lumaku pikeun pakét ieu?

Jinis sampel anu tiasa dianggo pikeun pakét ieu tiasa total RNA atanapi mRNA anu dimurnikeun kalayan integritas RNA anu saé. Upami total RNA dianggo ngawangun perpustakaan, disarankeun nganggo kit deplion rRNA (Cat # 4992363/4992364/4992391) pikeun ngaleupaskeun rRNA heula.

2. Naha sampel FFPE tiasa dianggo pikeun ngawangun perpustakaan nganggo kit ieu?

MRNA dina sampel FFPE bakal didegradasi dugi ka tingkat anu tangtu, kalayan integritas anu goréng. Nalika nganggo kit ieu kanggo pangwangunan perpustakaan, disarankeun ngaoptimalkeun waktos fragméntasi (pondok waktos fragméntasi atanapi henteu ngalakukeun fragméntasi).

3. Nganggo léngkah pamilihan ukuran anu disayogikeun dina manual produk, naon anu tiasa nyababkeun segmen anu dilebetkeun némbongan simpangan?

Pilihan ukuranana kedah dilaksanakeun saluyu sareng langkah ukuran ukuran dina manual produk ieu. Upami aya penyimpangan, alesanana panginten manik-manik magnét henteu saimbang sareng suhu kamar atanapi henteu kacampur sapinuhna, pipét henteu akurat atanapi cairanana tetep dina ujung. Disarankeun ngagunakeun tip ku adsorsi rendah pikeun ékspérimén na.

4. Pilihan adaptor dina pangwangunan perpustakaan

Kit pangwangunan perpustakaan henteu ngandung réagen adaptor, sareng disarankeun nganggo kit ieu sasarengan sareng TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC perpustakaan

Deteksi kuantitatif perpustakaan: Qubit sareng qPCR dianggo pikeun nangtukeun konsentrasi massa sareng konsentrasi molar perpustakaan masing-masing. Operasi ketat saluyu sareng manual produk. Konséntrasi perpustakaan umumna bakal nyumponan sarat tina urutan NGS. Deteksi kisaran distribusi perpustakaan: Ngagunakeun Agilent 2100 Bioanalyzer pikeun ngadeteksi kisaran distribusi perpustakaan.

6. Pilihan jumlah siklus amplifikasi

Numutkeun pitunjukna, jumlah siklus PCR nyaéta 6-12, sareng jumlah siklus PCR anu diperyogikeun kedah dipilih numutkeun input sampel. Di perpustakaan ngahasilkeun tinggi, over amplification biasana lumangsung dina sababaraha tingkat, anu diwujudkeun ku puncak anu rada ageung saatos puncak rentang target dina deteksi Agilent 2100 Bioanalyzer, atanapi konsentrasi Qubit anu dideteksi langkung handap tina qPCR. Hampang kusabab amplifikasi mangrupikeun fénoména normal, anu henteu mangaruhan sekuens perpustakaan sareng analisis data saterasna.

7. Paku nembongan dina profil deteksi Agilent 2100 Bioanalyzer

Munculna paku dina detil Agilent 2100 Bioanalyzer nyaéta kusabab fragméntasi sampel anu henteu rata, dimana bakal aya langkung seueur fragmen dina ukuran anu tangtu, sareng ieu bakal janten langkung atra saatos pengayaan PCR. Dina hal ieu, disarankeun henteu ngalakukeun pilihan ukuran, nyaéta netepkeun kaayaan fragméntasi kana 94 ° C salami 15 mnt diinkubasi, dimana sebaran fragmen alit sareng pekat, sareng homogénitasna tiasa ditingkatkeun.