FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix

A-1 RNA didegradasi

——Murni kualitas RNA anu teu aya kontaminasi. Bahan anu dicandak tina RNA kedahna seger-seger pikeun nyegah degradasi RNA. Nganalisis integritas RNA dina gél anu dipasihkeun sateuacan réaksi RT. Saatos ékstraksi RNA, éta kedah disimpen dina 100% formamida. Upami RNase sambetan dianggo, suhu pemanasan kedah <45 ° C, sareng pH kedahna kirang ti 8.0, upami sambetan anu ngahambat bakalan ngaleupaskeun sadayana RNase anu kaiket. Sumawona, sambetan RNase kedah ditambihkeun dina larutan anu ngandung ≥ 0,8 mM DTT.

A-2 RNA ngandung sambetan réaksi transkripsi balik

—— sambetan transkripsi réspon kalebet SDS, EDTA, gliserol, natrium pirofosfat, spéridin, formamida, uyah guanidine, sareng sajabana Campur kontrol RNA ku sampelna, sareng bandingkeun hasilna sareng réaksi RNA kontrol pikeun mariksa naha aya panghambat. Ngumbah RNA présipitasi kalayan 70% (v / v) étanol pikeun nyabut sambetan.

A-3 Henteu cukup anil tina primér anu dianggo pikeun nyintésis untaian munggaran cDNA

——Pastikeun yén suhu anil téh cocog pikeun bahan dasar anu dianggo dina ékspérimén. Pikeun héksamén acak, disarankeun tetep suhu dina 25 ° C salami 10 mnt sateuacan ngahontal suhu réaksi. Pikeun primér khusus gén (GSP), cobian GSP sanésna, atanapi gentos ka oligo (dT) atanapi héxamer acak.

A-4 Jumlah alit pikeun ngamimitian RNA

——Ningkatkeun jumlah RNA. Pikeun sampel RNA kirang ti 50 ng, 0,1 μg dugi 0,5 μg acetyl BSA tiasa dianggo dina sintésis untaian cDNA munggaran

A-5 Urutan udagan henteu dikedalkeun dina jaringan anu dianalisis.

——Cobian jaringan anu sanés.

Réaksi PCR A-6 gagal

—— Kanggo dua-léngkah RT-PCR, citakan cDNA dina léngkah PCR henteu tiasa ngaleuwihan 1/5 tina volume réaksi.

A-1 Annealing khusus pikeun primér sareng témplat

—— 3-tungtung buku dasar teu kedah ngandung 2-3 dG atanapi dC. Anggo primér khusus Gene dina sintésis untai munggaran tibatan primér acak atanapi oligo (dT). Anggo suhu anil anu langkung luhur dina sababaraha siklus kahiji, teras suhu anil anu langkung handap. Anggo hot-start Taq DNA polymerase pikeun PCR pikeun ningkatkeun spésifisitas réaksi.

A-2 Goréng desain primér khusus gén

——Tuturkeun prinsip anu sami pikeun desain primér amplifikasi.

A-3 RNA kacemar ku DNA génomik

——Rawat RNA nganggo PCR-grade DNase I. Setél réaksi kontrol tanpa transkripsi mundur pikeun ngadeteksi kontaminasi DNA.

A-4 Ngawangun primér dimer

——Desain primér teu aya rangkéan lawanna dina tungtung 3 '.

A-5 Gedé teuing Mg²⁺ konsentrasi

—— Optimalkeun Mg²⁺ konsentrasi pikeun tiap témplat sareng kombinasi primér

A-6 Kontaminasi sareng DNA asing

—— Anggo tip tahan aerosol sareng énzim UDG.

A-1 Eusi produk untai munggaran teuing tinggi

—— Ngurangan jumlah produk untai munggaran dina léngkah réaksi PCR konvensional.

A-2 Jumlah primér teuing dina réaksi PCR

——Kurangan input primér.

A-3 Teuing siklus

—— Optimalkeun kaayaan réaksi PCR sareng ngirangan jumlah siklus PCR.

A-4 Suhu anil anu handap teuing

——Ningkatkeun suhu anil pikeun nyegah inisiasi sareng panyambung khusus.

A-5 Penguatan non-spésifik tina fragmen oligonucleotide dihasilkeun ku DNase dégradasi DNA ——Ekstraksi RNA kualitas luhur pikeun nyegah kontaminasi DNA.

RT-PCR nyaéta ngabalikkeun narjamahkeun RNA kana cDNA, teras nganggo cDNA anu ditranskripsi tibalik salaku témplat pikeun réaksi PCR pikeun ngagedéan sempalan target. Milih primér acak, primér Oligo dT sareng gén khusus numutkeun kaayaan spésipik percobaan. Sadaya bahan dasar di luhur tiasa dianggo pikeun mRNA sél eukariotik pondok tanpa struktur hairpin.

Primer acak: Cocog sareng RNA panjang kalayan struktur hairpin, ogé sadayana jinis RNA sapertos rRNA, mRNA, tRNA, sareng sajabana. Utamina dianggo pikeun réaksi RT-PCR tina témplat tunggal.

Oligo dT: Cocog sareng RNA kalayan tailing PolyA (prokaryotic RNA, eukaryotic Oligo dT rRNA sareng tRNA henteu ngagaduhan buntut PolyA). Kusabab Oligo dT kaiket kana buntut PolyA, kualitas sampel RNA diperyogikeun janten tinggi, sareng bahkan sajumlah dégradasi alit bakal ngirangan jumlah sintésis cDNA sapuratina.

Primer khusus spésifik: Lengkep kana sekuen témplat, cocog pikeun kaayaan dimana sekuen udagan dipikanyaho.

Aya dua cara:

1. Metode rujukan internal: Dina tiori, cDNA mangrupikeun fragmen DNA anu benten panjangna, janten hasilna éléktroforesis nyaéta smear. Upami kaayaanana RNA kirang, moal aya produk anu bakal ditingalikeun dina éléktroforésis, tapi ieu henteu hartosna henteu produk bakal dikuatkeun ku PCR. Sacara umum, rujukan internal tiasa dianggo pikeun ngadeteksi cDNA. Upami rujukan internal ngagaduhan hasil, kualitas cDNA tiasa dasarna dijamin (dina sababaraha kasus, upami fragmen gén target panjang teuing, panginten tiasa aya pengecualian).

2. Upami aya gén anu dipikaterang dikuatkeun ku témplat ieu, éta tiasa diverifikasi ku bahan dasar gén ieu. Penguatan rujukan internal henteu merta hartosna yén teu aya masalah sareng cDNA. Kusabab rujukan internal gaduh seueur pisan cDNA, gampang pikeun nguatkeun. Upami cDNA parsial didegradasi kusabab sababaraha alesan, tina sudut pandang probabilitas, hasil PCR tina gén target udagan anu handap bakal kapangaruhan pisan. Nalika rujukan internal masih seueur pisan, amplifikasi sigana moal kapangaruhan.

Parsial ngaruksak RNA. Ngadeteksi integritas sareng pemurnian RNA

Eusi RNA tina spésiés anu béda tiasa béda, tapi sacara umum, total RNA anu diekstraksi kedah ngandung dua pita 28S sareng 18S anu jelas dina éléktroforésis gél, sareng kacaangan band anu baheula kedah dua kali langkung luhur tibatan anu terakhir. Pita 5S nunjukkeun yén RNA parantos didegradasi, sareng kacaanganana sabanding sareng tingkat dégradasi. Penguatan référénsi internal anu berhasil henteu hartosna yén teu aya masalah sareng RNA, kusabab rujukan internalna seueur pisan, RNA tiasa diperkuat salami dégradasi henteu parah. The OD₂₆₀/ OD₂₈₀babandingan RNA murni diukur ku spéktrofotométer kedah antara 1,9 sareng 2.1. Sajumlah leutik kekotor protéin dina RNA bakal ngirangan babandingan. Salami hargina henteu handap teuing, RT moal kapangaruhan. Anu paling penting pikeun RT nyaéta integritas RNA.

Penyuluhan gén rujukan internal ngan ukur tiasa nunjukkeun yén RT parantos hasil, tapi éta henteu merta hubunganana sareng kualitas untai cDNA. Kusabab fragmen rujukan internal umumna ukuranana leutik sareng éksprési luhur, maka langkung gampang janten suksés dina transkripsi balik. Nanging, ukuran sareng éksprési gén target beda-beda ti gén ka gén. Kualitas cDNA henteu tiasa ditilik ukur ku rujukan internal khususna pikeun fragmen target langkung lami tibatan 2 kb.

Sababaraha sampel ngagaduhan struktur sékundér kompléks, atanapi ngagaduhan kontén GC anu beunghar, atanapi mulia kalayan kaayaanana rendah. Dina kasus ieu, transkripase sabalikna anu pas kedah dipilih numutkeun ukuran tina sempalan udagan sareng sampelna. Pikeun témplat RNA kalayan eusi GC anu luhur sareng struktur sékundér rumit, sesah pikeun muka struktur sékundér dina suhu handap, atanapi ku transkripase sabalikna umum. Pikeun témplat ieu, Quant Reverse Transcriptase tiasa dipilih, kumargi kinerja transkripsi balikna jelas langkung saé tibatan M-MLV series reverse transcriptase, anu tiasa ngabalikkeun nyerat sababaraha témplat RNA sacara éfisién sareng nyalin RNA kana untaian munggaran cDNA dugi ka maksimal. Nalika ngagunakeun kit transkripase sabalikna umum, sistem 20 μl ngan ukur épéktip tiasa ngabalikkeun transkrip 1 μg tina total RNA. Punten perhatoskeun kapasitas RT maksimal pikeun kit. Upami citakan ditambihan kaleuleuwihan, transkripsi tibalik bakal nguntungkeun RNA kalayan seueur pisan. Kituna, langkung saé henteu ngaleuwihan kapasitas maksimum sistem.

A-1 Tangtukeun naha RNA didegradasi parah sareng upami RT suksés

Sacara umum, alesan pikeun gagalna amplifikasi rujukan internal sering disababkeun ku dégradasi RNA anu serius. Alesan anu sanésna nyaéta gagal transkrip tibalik. Rujukan internal henteu tiasa dianggo salaku standar pikeun nangtoskeun kualitas untai tunggal cDNA, tapi éta tiasa dianggo salaku standar pikeun nangtoskeun naha transkripsi balik suksés upami teu aya masalah kualitas RNA. Hal anu paling penting dina prosés transkripsi tibalik nyaéta ngajaga suhu anu tetep sareng sistem réaksi anu konstan dina raraga ningkatkeun épisiénsi réaksi.

A-2 Nangtukeun naha primér pikeun nguatkeun gén rujukan internal tiasa dipercaya sareng upami aya masalah sareng réagen anu dianggo dina PCR.

Pikeun kuantifikasi relatif, RNA kedah diitung sateuacan transkripsi balik, anu ogé diperyogikeun dina seueur kit transkripsi balik, contona, ngitung input RNA salaku 1 μg. Kusabab cDNA anu ditranskripsi tibalik mangrupikeun larutan campuran, kalebet RNA, oligo dT, énzim, dNTP, sareng bahkan résidu DNA sakedik, panyimpangan bakal disababkeun, janten teu mungkin pikeun akurat ngitung cDNA. Ku alatan éta, kuantifikasi RNA perlu. Mertimbangkeun épisiénsi transkripsi tibalik sami sareng sampel anu sanés, jumlah cDNA anu dipikagaduh kedah sami, sareng analisis kuantitatif tiasa nunjukkeun perbandingan tingkat éksprési gén anu béda dina jumlah anu sami tina total RNA. Nalika ngalakukeun PCR kuantitatif fluoresensi relatif, cDNA kuantitatif tiasa henteu diperyogikeun saatos transkripsi mundur sabab gén rujukan internal tiasa dipilampah salaku rujukan.

Hal ieu utamina aya hubunganana sareng gén, sareng transkripsi mundur tina fragmen panjang henteu tiasa dilakukeun pikeun kaseueuran gén. Mimiti, épéktisi transkripsi tibalik jauh langkung handap tibatan PCR. Bréh, daérah anu euyeub ku GC sareng struktur sékundér seueur gén ngawatesan duanana transkripsi tibalik sareng PCR. Tungtungna, kasatiaan sareng épisiénsi amplifikasi PCR sesah ngajamin dina waktos anu sami. Dina prosés transkripsi terbalik, teu aya anu tiasa ngajamin kéngingkeun sempalan panjang pikeun gén salinan handap, utamina nganggo oligo dT. Sedengkeun pikeun 5 'UTR kalayan langkung seueur GC, éta bahkan langkung hésé. Kusabab kitu, éta masih mangrupikeun cara anu wajar pikeun ngabalikkeun transkrip sareng primer acak, mendakan situs beulahan alam dina sempalan target, nguatkeun ku segmen, teras ngalakukeun larangan pencernaan sareng ligasi. Sacara umum, sesah pikeun sacara langsung ngagedékeun fragmen anu langkung ageung tibatan 2 kb, tapi henteu mustahil pikeun diala: 1. Mimiti, ngajamin integritas RNA / mRNA, sareng ékstraksi TRIZOL langkung disukai. 2.M-MLV RT-PCR kit tiasa langsung dianggo. Manjangkeun waktos anilasi sareng ningkatkeun jumlah siklus dina prosés amplifikasi leres. Alternatipna, PCR anu bersarang tiasa dilarapkeun, atanapi ngalaksanakeun hiji atanapi dua réaksi heula kalayan leres-leres perpanjangan denaturation sareng waktos perpanjangan sateuacan amplifikasi PCR normal, anu tiasa ngabantosan manjangkeun fragmen. Nengetan kasatiaan polimérase. 3. Long Taq tiasa dianggo dina PCR pikeun kéngingkeun hasil anu ideal. 4. Pikeun aplikasi ungkapan protéin, polimérase kasatiaan luhur kedah dilarapkeun.

Aya dua jinis transcriptase tibalik anu ditawarkeun ku TIANGEN: Quant / King RTase sareng TIANScript M-MLV. Beda utama antara aranjeunna nyaéta jumlah input tina témplat. Quant mangrupikeun transkripase terbalik anu unik, anu bénten sareng M-MLV anu biasa dianggo tina Moloney murine leukemia virus. Quant mangrupikeun transcriptase balik-épisiensi tinggi anu anyar anu dikedalkeun deui ku rékayasa Escherichia coli. Quant cocog pikeun nguatkeun 50 ng-2 μg RNA kalayan aktipitas transkripsi luhur tibalik sareng ngahasilkeun tinggi. Dibandingkeun sareng MMLV biasa atanapi AMV, ciri anu paling ageung ku Quant nyaéta ngagaduhan pangirut anu kuat sareng témplat RNA sareng tiasa ngabalikkeun témplat kompléks transkrip tanpa députasi suhu tinggi. Pikeun témplat anu ngagaduhan eusi GC langkung luhur, épisiénsi tibalik langkung luhur. Nanging, transkripase tibalik ieu ngagaduhan kagiatan RNase H, anu tiasa mangaruhan panjang produk cDNA (cocog pikeun témplat <4,5 kb). Pikeun transkripsi balik konvensional, TIANScript MMLV tibalik transkripase disarankeun. RTase ieu mangrupikeun énzim anu dirobih ku kagiatan RNase H lemah pisan, anu cocog pikeun sintésis cDNA panjang (> 5 kb).

Transkripsi sabalikna hiji-léngkah sareng amplifikasi PCR réngsé dina tabung anu sami tanpa muka tutup tabung antara sintésis cDNA sareng amplifikasi, anu ngabantosan pikeun ngirangan kontaminasi. Kusabab sadaya sampel cDNA anu di anggo dianggo pikeun amplifikasi, sensitipitasna langkung luhur, kalayan minimal 0,01 pg tina total RNA. Pikeun suksés hiji-léngkah RTPCR, primér khusus gén umumna dianggo pikeun ngamimitian sintésis cDNA. Metode dua léngkah, nyaéta transkripsi balik sareng amplifikasi PCR dilaksanakeun dina dua léngkah. Mimiti transkripsi balikkeun dilaksanakeun tina témplat RNA pikeun kéngingkeun cDNA, sareng cDNA anu diala tunduk kana hiji atanapi langkung réaksi PCR anu béda. Metodeu dua léngkah tiasa ngagunakeun oligo (dT) atanapi primér acak pikeun nungtun sintésis untaian munggaran cDNA, sareng tiasa ngabalikkeun transkripsi sadaya inpormasi mRNA tina sampel anu khusus.